许多细胞内重要生物反应涉及到钙流。检测细胞内瞬间钙流变化对细胞内生物反应的研究及靶向药物研发至关重要。钙特异性结合荧光染料法是检测细胞内钙流的最常用的手段。

Fluo-8作为新一代钙流检测染料提高了细胞装载和钙反应，同时保持了Fluo-3和Fluo-4光谱波长Ex/Em≈490/520 nm。Fluo-8 AM也可以在室温下装载到细胞中，而Fluo-3 AM和Fluo-4 AM需要37℃进行细胞装载。此外，Fluo-8 AM比Fluo-4 AM亮两倍，比Fluo-3AM亮四倍。

钙流染料在细胞装载及钙流分析中常需要进行细胞洗涤，这显著增加了检测中的工作流程，由于一些细胞可以在洗涤过程中脱落，这也增加了分析中数据变量。因此，免洗染料及方法是现在的发展趋势。

为了减少染料被细胞转运到细胞外，阴离子转移蛋白抑制剂丙磺舒需要加到染料加载溶液及后续的分析溶液中。

·免洗

在整个分析过程中，不需要经过细胞洗涤过程。细胞洗涤可以降低细胞本底荧光，但增加了操作步骤，增加了细胞脱落及孔间差异风险。

·更高的灵敏度

Fluo-8荧光强度比Fluo-3，Fluo-4强。

·检测方便

Fluo-8可以用与Fluo-4相同的检测仪器及荧光通道。针对某种细胞的具体实验参数，如细胞密度，温度，体积，时间，仪器收集及分析设定等，需通过预实验确定。

·适合于高通量检测

反应可以在96孔或384孔板上进行，满足一次同时进行大批量的微孔板实验需求。

1. 细胞准备

a) 正常培养基培养的细胞胰酶消化后，加完全培养基，细胞计数，取需要的细胞总数，离心。以下是按96孔板的建议用量，384板需要的细胞数及体积，对应调整。96孔培养板一般建议每孔细胞20,000左右。

b) 用Hank’s盐溶液或类似无酚红培养液，加胎牛血清至1%浓度，用该培养液重新悬浮上述离心后的细胞。然后铺细胞于培养板，每孔50 ml。细胞培养3-5小时至贴壁或过夜。

2. 染料装载

a) 取出缓冲液在室温平衡30分钟，颠倒混匀几次。如果缓冲液注明是10x 浓缩液，需要用去离子水稀释成1x的工作缓冲液。

b) 取出Fluo-8试剂，室温平衡5-10分钟，离心将管内容物集中于管底。如果试剂不是一次性用完，可以对试剂进行分装，分装后的Fluo-8试剂继续-20℃保存，减少冻融次数。注意避光。

c) 计算好需要的染料装载液体积，按每孔50 ml计算。将Fluo-8试剂加于1x的工作缓冲液，充分混匀。Fluo-8试剂用量建议起始按1:100稀释到工作缓冲液中，稀释度可根据不同细胞株及需求调整。

d) 计算需要的丙磺舒储存液体积，加入到上述Fluo-8 工作缓冲液中，充分混匀，此为装载液。

e) 吸去培养板孔中的培养液，将装载液加到细胞培养板孔，每孔50 ml。轻轻振摇10秒钟，加盖，37℃ 培养 1小时。

3. 细胞内钙流检测

a) 准备化合物及激动剂：激动剂建议不少于6个浓度梯度。每反应板设立未加激动剂或化合物的对照孔。激动剂/化合物板每孔100-200 ml体积。

b) 准备与检测仪配套的专用移液枪头盒。

c) 准备检测缓冲液：检测缓冲液是加了丙磺舒的Hank’s盐缓冲液。

d) 吸去培养板孔中的染料装载液，每孔加检测缓冲液100 ml。

e) 设定好仪器检测程序及各相关参数，检测波长为490/525nm，每1-3秒读1次，连续读2分钟。

f) 在加激动剂/化合物前读取一次基础读数。

g) 设定好化合物/激动剂板孔及枪头与实验细胞的对应位置。

h) 启动加激动剂/化合物的检测程序，收集实验数据。

i) 用（F-F0)/F0 *100%的方法或其它被验证的方法进行数据处理分析。