1. 细胞准备：待检测孔细胞需要在25至15000个细胞范围内。贴壁细胞吸去培养液后，用室温的DMEM无血清培养液洗涤一次，弃洗涤液后，加细胞裂解液。悬浮细胞离心吸去培养液后，用室温的DMEM无血清培养液洗涤一次，弃洗涤液后，加细胞裂解液。
2. 细胞裂解：96孔培养板每孔加50 ml L试剂，384孔培养板每孔加10 ml L试剂，轻拍培养板数次，室温振摇10 至15分钟。细胞裂解产物（lysate）使用完之后需要尽快放回 2～8℃保存，低温保存时间不超过8小时。不建议长期保存细胞裂解产物。
3. RT-qPCR 准备：按下列次序准备20 ml 反应体系：10 ml B试剂，4 ml E试剂，2 ml引物探针mix，2 ml 细胞裂解产物模板，2 ml 无酶水。20 ml反应体系中细胞裂解产物不建议超过2 ml。
4. RT-qPCR扩增：逆转录42～50℃, 20～30分钟，然后95℃ 1分钟。qPCR 参数需要根据特定的目标基因及引物序列的预实验结果确定。以下是一个housekeeping基因的扩增设定，供参考：
逆转录：45℃，20分钟；然后95℃ 1分钟。
PCR扩增：94℃ 20秒，56℃ 20秒，65℃20秒 （收集荧光信号），35～40个循环；然后72℃ 3分钟。
5. 必要时进行熔解曲线分析。
6. 结果分析。
