1. 待测细胞培养基准备
1) 从对数生长期的细胞培养中取1mL细胞培养基。
2) 细胞培养基室温离心 200 g ，5分钟。将大约800 μL培养基转到新的离心管中，注意不要带入离下的细胞碎片
3) 用以上准备的细胞培养基作为巢式PCR的模板进行支原体检测。
2. 巢式PCR反应
1) 第一PCR反应：以通用的2X PCR 预混液试剂为例：
PCR反应组装（推荐冰上配制）
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组分
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体积（μL）
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2xPCR Mix
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25
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1st PCR 引物P1
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2
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模板（细胞培养基）
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1
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PCR反应内参
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2
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加无菌超纯水至
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50
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PCR反应条件: 30循环，条件见下表
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步骤
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温度
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时间
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循环数
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预变性
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94℃
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5min
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1
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变性
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94℃
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30s
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30
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退火
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55℃
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30s
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30
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延伸
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72℃
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40s
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30
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终延伸
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72℃
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5min
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1
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2) 从第一PCR反应中取1μL 作为第二PCR的模板并用引物P2进行第二PCR。第二PCR反应组装（推荐冰上配制）见下表。PCR反应条件同第一PCR反应。
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组分
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体积（μL）
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2xPCR Mix
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25
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2nd PCR 引物P2
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2
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模板（1st PCR产物）
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1
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加无菌超纯水至
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50
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3) 准备2% 的琼脂糖胶。取10 µl 的第二PCR产物做DNA电泳。
3. 结果
PCR反应内参为515 bp单一DNA条带，常见支原体污染会产生236 bp-365 bp单一DNA条带，Acholeplasma laidlawii 污染会产生426 bp和 219bp的双DNA条带。
