A：1.引物设计：需要以RNA序列为依据，扩增产物至少覆盖2个外显子，确保扩增系统不能以基因组DNA为模板进行扩增，而只能以RNA为模板进行扩增。在下列情况下可以实现：a. 2个外显子之间的内含子比较长，以基因组为模板的扩增长度明显超出系统中的聚合酶在扩增延伸时间内所能完成的扩增长度；b. 2个外显子之间的内含子比较短，但至少有一条引物的最3末端的2～5个碱基与其5末端一侧的其余碱基分布在不同的外显子上且与邻近内含子碱基序列不同（参考下图），使得以DNA为模板的扩增成为不可能。必要时请联系产品技术支持协助。 2.探针设计：探针长度18～28个碱基，Tm比引物高8～10 ℃, 不含3个以上连续的G，5末端不是G。探针5末端带荧光基团，3末端带淬灭基团。 3.PCR扩增参数及体系：任何一个PCR，任何一套扩增引物探针，都需要经过预实验，确定最佳扩增温度与时间设定，引物量，酶量，甚至Mg2+ 浓度调整，这对检测特异性与灵敏度非常重要。需要做类似细胞数梯度检测预实验，在获得良好的线性关系之后再开始微孔板大通量实验。 4.熔解曲线：熔解曲线分析可以完美地区分特异性的与非特异性的扩增。熔解曲线分析在预实验实验参数确定过程中就需要使用。荧光探针扩增体系做熔解曲线前需要在扩增完成后加入双链DNA结合的荧光染料（如SYBR Green），标记在探针上的荧光染料不能用于熔解曲线分析。